Una visione recente del virus dell’encefalite circolante in popolazioni animali frammentate nel nord Italia

Isolamento del virus

Solo 68 campioni, su 72, hanno infettato con successo la linea cellulare BHK-21, con conseguente replica dell’intero effetto citogenetico. L’isolamento del virus dei restanti cinque campioni ha prodotto risultati negativi dopo il terzo passaggio.

Caratterizzazione dei ceppi prevalenti

Analisi del profilo antigenico

68 isolati (Tabella Supplementare S1) sono stati testati utilizzando un pannello di 39 MAbs, in grado di identificare sette regioni antigeniche, che includono più epitopi, epitopi conformazionali e lineari ed epitopi interni ed esterni. Anche 20 MAbs (Fig. 3) sono coinvolti nella neutralizzazione del virus^33,34.

Caratterizzazione del profilo antigenico di isolati moderni. Rappresentazione grafica dell’interazione di MAbs contro i più recenti isolati di EMCV considerati nell’analisi. Le righe superiori delle tabelle indicano le caratteristiche dei MAbs: nomi, proprietà degli epitopi, regioni e coinvolgimento finale nella neutralizzazione del virus. Le lettere da A a R, a sinistra, indicano cluster generati da cluster di campioni analizzati in base all’eterogeneità nella reazione anticorpale catalizzante e la dimensione di ciascun cluster è indicata a fianco. I colori dei quadrati denotano il livello di interazione: nero, alto; Medio grigio-bianco, voga. L’immagine ha rivelato una generale eterogeneità dell’interazione dei MAb inclusi nelle regioni 1, 2 e 7 e una variazione discreta, ma occasionale e incoerente, rispetto agli altri MAb. Nell’immagine è evidente la conservazione dell’elevata reattività di 3A3 II (colonna completamente nera) e la perdita di reattività di 4H2 (colonna quasi interamente bianca). Anche i cambiamenti negli epitopi della regione 2 dei campioni assemblati nel cluster C, con conseguente perdita di interazione da parte di specifici MAbs, possono essere chiaramente osservati.

La sonda mediante intrappolamento del saggio ELISA e l’annotazione dei risultati (mostrata in 2.3) hanno fornito una percentuale della reazione rispetto al ceppo omozigote. Per ottenere dati più semplici e comprensibili, queste percentuali sono state classificate in tre diversi livelli: alto, quando era superiore al 70%; medio, quando era compreso tra il 70 e il 25%; e null , quando era inferiore al 25%. Dopo questa classificazione, gli isolati sono stati raggruppati secondo l’omogeneità nella reazione in 18 gruppi. Ciascun gruppo era composto da uno o più isolati, elencati dalla A alla R dal più al meno numeroso.

Il profilo ottenuto ha rivelato una stabilità antigenica generale dei campioni studiati, particolarmente forte nelle regioni 1, 2 e 7 (Fig. 3). Le prime due regioni presentano epitopi conformazionali che vengono riconosciuti neutralizzando MAb sia nei capsidi intatti che parzialmente degradati.³⁴. Gli anticorpi in grado di identificare gli epitopi coinvolti in queste regioni hanno mantenuto un’elevata reattività contro il 75% dei campioni testati, ad eccezione di MAb 4H2. Anche la regione 7 è costituita da epitopi corrispondenti, ma è riconosciuta da MAb non neutralizzanti e solo in capsidi interi³⁴. In questo caso, il 95% dei campioni è stato identificato con un livello di interazione molto elevato (Fig. 3).

Un altro sito antigenico altamente conservato era un epitopo linearizzato di VP3; MAb 3A3 II (regione 4), che delinea quell’epitopo, ha interagito completamente con tutti i campioni testati (Fig. 3).

Le restanti regioni antigeniche, che sono state rilevate da MAbs non neutralizzanti (regioni 4, 5 e 6) hanno mostrato una variazione discreta. Gli epitopi più variabili si trovano nella regione 5 e specifici MAbs contro questa regione hanno mostrato livelli di interazione invariati solo per il 45% dei campioni (Fig. 3).

Due siti antigenici, rispettivamente, riconosciuti da MAbs 3G6 e 4H2, hanno mostrato una variabilità antigenica molto elevata. La diminuzione della reattività del primo anticorpo, un MAb non neutralizzante che riconosce gli epitopi conformazionali della regione 4, è stata più lieve e ha riguardato solo una piccola parte della popolazione virale; La sua reazione è stata più debole contro il 37% dei campioni e completamente persa contro il 25% (Fig. 3). La neutralizzazione di MAb 4H2, coinvolta nel rilevamento di un epitopo corrispondente nella regione 2, ha rivelato cambiamenti più gravi. L’anticorpo ha rilevato solo il 4% degli isolati selezionati mentre non ha reagito completamente nell’80% dei casi. Il restante 16% corrisponde a una reazione più blanda (Fig. 3).

Infine, tutti i MAb nella regione 2, tranne 4E11 e 4H4, hanno perso completamente la loro reattività contro gli isolati del gruppo C. È interessante notare che quattro di questi ceppi si sono raggruppati molto strettamente nell’albero filogenetico (Fig. 4b; iii).

Albero filogenetico massimo per i ceppi EMCV. Analisi filogenetica dei ceppi EMCV basata sulla sequenza genica codificante per la proteina capside 1D (VP1). (un) L’analisi EMCV includeva isolati e ceppi raccolti nei database, elencati rispettivamente nelle tabelle supplementari S1 e S2. L’albero risultante è ottenuto con il metodo Maximum Likitality con 1000 bootstrap (vedi testo). Le sequenze, che appartengono tutte a EMCV-1, raggruppate in 6 linee lineari (le sequenze LIN A – LIN G, LIN F non sono state incluse nell’analisi), secondo Vyshemirskii e colleghi.⁴⁰. (B) Zoom in del LIN B, inclusi tutti i campioni considerati dall’analisi. Le parentesi indicano le sottopopolazioni più vicine: (I) ceppi isolati da ospiti selvatici presso il Wild Animal Recovery Center vicino a Grosseto (Toscana); (II) ceppi isolati da primati nel Parco Naturale “Natura Viva” in provincia di Verona (Veneto); (III) ceppi isolati nel 2015 in Emilia-Romagna e raggruppati nel Gruppo C del Panel Antigenico; (IV) Ceppi isolati da campioni originari del paese di Frida in provincia di Brescia (Lombardia), che mostrano una maggiore distanza filogenetica. ceppi di asterisco che derivano da un campionamento consecutivo in tre colture; * Un allevamento situato in provincia di Cremona (Lombardia) con esemplari molto ravvicinati; ** Azienda situata in provincia di Verona (Veneto) e distribuita in diversi gruppi; *** Azienda situata in provincia di Brescia (Lombardia) con evidenza di incroci raggruppati. I valori Bootstrap sono indicati sopra i rami, quando sono inferiori a 0,7 vengono cancellati.

Caratterizzazione molecolare

L’analisi filogenetica che codifica le sequenze degli isolati di VP1 (1D), insieme a quelle disponibili online, ha fornito i dati per effettuare la caratterizzazione molecolare dei ceppi di EMCV circolanti nel nord Italia (Tabelle Supplementari S1 e S2).

L’albero filogenetico ML ottenuto (Fig. 4a) ha confermato che tutti i ceppi analizzati potevano essere raggruppati in sei su sette ceppi EMCV di tipo 1, come suggerito in precedenza.^39E40E4142. La sequenza basata sui dati appartenente a LIN F non è stata inclusa nell’analisi (Fig. 4a).

Tutti gli isolati sequenziati sono stati posti nella LIN B, insieme ad altri ceppi europei (belga e cipriota) e strettamente imparentati con gli antichi ceppi italiani precedentemente analizzati (ITL-138/86 e ITL-001/96; Fig. 4a), con una spaziatura rapporto del 3,38% e del 9,76% (media 7,02%). Interessanti sono anche gli unici ceppi EMCV isolati da ospiti umani^{19, 20} Raggruppato nello stesso pedigree con la sottospecie dell’Unione Europea, anche se proviene dal Perù. LIN B si distingue dall’includere il ceppo storico e tipico di EMCV, il ceppo Mengo-M, la cui sequenza 1D differisce di circa il 21% da quella degli altri ceppi.

Un’approfondita analisi della LIN B ha confermato che i campioni del Parco Naturale “Natura Viva” e del Centro di Soccorso WWF sono raggruppati in due cluster più piccoli (entrambi con bande di primer pari a 1 e 1D sequence spacing inferiore allo 0,6%), evidenziando la maggiore prossimità tra i virus circolanti in quegli spazi definiti, limitati e chiusi (Fig. 4b; i e ii).

Come accennato nella sezione “Origine dei virus”, sono state selezionate tre colture con casi ricorrenti di EM situati in un’area endemica per monitorare l’infezione nel tempo, concentrandosi sulla vicinanza genetica dei ceppi virali circolanti in una singola coltura in anni diversi. In due stormi, gli isolati raccolti dalla stessa azienda negli anni successivi sono stati strettamente raggruppati in piccoli gruppi definiti con nodi di origine con serrature palpabili (rispettivamente 1 e 0,98; Fig. 4b; * e ***). Al contrario, i ceppi virali raccolti contemporaneamente o successivamente dalla coltura III sono stati distribuiti in diversi gruppi nell’albero filogenetico con apprezzabile cambiamento genetico (Fig. 4b; **).

La distribuzione dei rimanenti isolati italiani nel lignaggio non mostrava cluster di specificità geografica o temporale (Fig. 4b). Solo tre campioni, raccolti da allevamenti situati nello stesso paese nel nord Italia, in provincia di Brescia, non hanno seguito questa tendenza e sono stati separati rispetto a tutti gli altri isolati europei, ma ancora raggruppati in LIN B, (Fig. 4b; iv).

Monitoraggio sierologico degli animali da reddito e selvatici

È stata intrapresa un’indagine sierologica delle popolazioni suine nella regione che comprende Lombardia ed Emilia-Romagna per determinare la reale estensione della prevalenza di EMCV nell’Italia settentrionale e la frequenza del decorso subclinico virale.

I dati ottenuti hanno rivelato che la percentuale di allevamenti positivi nel 2016 è stata del 63% e confrontando tali dati con gli anni precedenti è aumentata con una significatività statistica (S valore <0,001) nel numero di colture positive era evidente (Fig. 5a). Gli allevamenti positivi erano il 40% nel 2010 e solo il 9% nel 2000²⁹. È interessante notare che il tasso di colture negative con sieroprevalenza inferiore al 10% è rimasto invariato nel tempo (26% nel 2000).²⁹25% nel 2010 e 26% nel 2016) rivelando che i cambiamenti hanno interessato solo colture positive e non valide (Fig. 5a).

Indagine sierologica su allevamenti di suini nel nord Italia. I grafici confrontano l’indice di sieroprevalenza ottenuto durante una sieroindagine degli allevamenti suini della Lombardia e dell’Emilia-Romagna nel 2016 con i dati del 2010 e del 2000. Gli allevamenti sono considerati positivi (neri) se la percentuale di positivi sieropositivi è superiore al 10% e negativi con un basso percentuale di sieropositività. . I negativi includono colture con una sieroprevalenza pari a 0 (bianco) e con una sieroprevalenza inferiore al 10% (punteggiata). (un) Totale aziende agricole considerate. (B) Le mandrie sono suddivise tra ingrasso e allevamento. Sono stati considerati solo i dati del 2010 e del 2016. Le differenze tra i dati sono state convalidate statisticamente con il test esatto di Fisher unilaterale e S Il valore ottenuto per tutte le coppie confrontate era inferiore a 0,001. *, nel 2000²⁹Le sierocolture sono state suddivise in base al rapporto di sieroprevalenza in quattro gruppi: Nij, <5٪ ، 5-15٪ ،> 15%. Tutte le colture con un tasso di sieroprevalenza inferiore al 15% sono state considerate “negative con sieroprevalenza” (punteggiate).

Dividendo gli allevamenti in due gruppi, tra ingrasso e allevamento, si è osservata una differenza significativa. Anche se è stato osservato un aumento della sieroprevalenza in entrambi i gruppi dal 2010 al 2016, la percentuale di allevamenti positivi è stata maggiore nei allevamenti da riproduzione (Fig. 5b). Nei broiler la sieroprevalenza cresce dal 19% al 40,5%, mentre negli allevamenti dal 57 all’84% in 6 anni (S valore < 0,001; Figura 5b).

Dividendo invece gli allevamenti in due gruppi, il primo comprendente quelli con diagnosi di casi EMC e il secondo contenente quelli esenti da malattia clinica, non si evidenziano differenze significative nella percentuale di allevamenti sieropositivi (dati non riportati).

È interessante notare che le indagini sierologiche su coorti di suini hanno rivelato una circolazione molto bassa del virus nella fauna selvatica, con solo il 6% circa degli animali sieropositivi contro EMCV (Tabella 2).